第２８回（平成１４年１月１９日 於：熊谷高校）
参加者： 阿部（上尾南高） 小栗（秀明栄光高） 小林（熊谷高） 平岩（越谷南高） 森田（川越女子高） 加藤（熊谷高） 敬称略
準備：大豆、尿素、フェノールフタレイン…ウレアーゼの実験に使用。
ブタの心筋（ハツ）、コハク酸ナトリウム、メチレンブルー…デヒドロゲナーゼの実験に使用。
酵母菌（ドライイースト）、グルコース、キューネ発酵管…チマーゼの実験に使用。
その他に、セロハンチューブ、ミキサー、乳鉢、試験管、ビーカー、ピペット、ロート、石英砂、ガーゼ、水槽など。
実験経過
ウレアーゼの実験 ※ウレアーゼは尿素をアンモニアと二酸化炭素に加水分解する酵素です。
酵素液の作成
ウレアーゼはかなり広く生物界に見られる酵素ですが、材料としては大豆が一番適しているようです。
一晩水に浸けた大豆（乾燥時５ｇ）を細かく刻み、水１０ｍｌを加えて乳鉢ですりつぶします。さらに水９０ｍｌを加えてかき混ぜ、ガーゼで濾して出来上がりですが、ミキサーを使えばもっと手っ取り早く出来ます。つまりは生豆乳です。市販の豆乳では加熱してあるので使えません。
酵素液の働きを調べる
試験管に１ｍｏｌ/ｌの尿素水溶液２ｍｌ、酵素液を４ｍｌ、フェノールフタレインを１滴加えて色の変化を観察します。
初めは豆乳の色で全体的に白濁していますが、ウレアーゼによって尿素からアンモニアを生じるとアルカリ性になるため、フェノールフタレインと反応して赤色に変化します。
対照実験として酵素液にフェノールフタレインを１滴加えたもの、尿素水溶液にフェノールフタレインを１滴加えたものを用意するとそれぞれ色の変化が見られないことから、酵素が尿素を分解したことが明らかになります。
また、加熱した酵素液では色の変化がないので酵素の失活も明らかに出来ます。
今回の実験では全てそのとうりに反応しました。このように、ウレアーゼでは指示薬を用いて色の変化で反応が見られるため、反応していることが明らかに分かりやすいという利点があります。また、作りやすさや数日の保存が利くこと、コストがかからないこと、低温でもよく反応することなど結構実験に使える酵素です。
対照 変化したもの
透析実験
ハーディとヤングがチマーゼで行ったように、酵素液を半透膜（セロハン）で透析して、アポ酵素と補酵素に分離してみることが、今回のテーマです。しかし、後述するようにチマーゼで上手くいかないために他の酵素ではどうかということでやってみました。２，３日透析したものでは分離が見られず、透析したセロハン内の酵素液も透析していない酵素液も同じように赤色の反応が見られました。また、一週間透析したものでは透析していない酵素液でも失活していました。もっとも、ウレアーゼに補酵素はあるのかも不明でしたが、ネットで調べたところどうもニッケルを含むようで、おそらくヘムのようにタンパク質部にしっかりと結合しているものと思われます。
デヒドロゲナーゼの実験 ※デヒドロゲナーゼは呼吸基質から水素を取り去る脱水素酵素です。
デヒドロゲナーゼは呼吸に用いられる脱水素酵素なので、大抵のものが材料として使えます。しかし、植物よりも動物からのもの方が反応が強くまた、早く見られます。予備実験ではモヤシの絞り汁でもやって見ましたが、前述の理由により今回はブタの心筋の絞り汁を用いました。普通は酵母菌で行うようですが、透析実験を行うためには酵母菌の破壊と酵素の抽出を行わなければならず、後述するように酵母菌ではそれが困難であるために、ブタとなったわけです。また、実験書にはニワトリの胸筋（ササミ）も載っていますが、やってみると反応は見られませんでした。「筋なしササミ」ということから何か処理をしてあり、その結果酵素が失活したものと思われます。
酵素液の作成
ブタの心筋（ハツ）１００ｇに対して水１００ｍｌ（実験書では２００ｍｌ）を加えミキサーで処理します。それをさらに乳鉢で石英砂を加えよくすりつぶしたものをガーゼでこし、ろ紙でろ過します。こうして得られる薄い赤色（血の色）をした抽出液を酵素液としました。やってみると分かりますが、手間がかかるわりに収量は少ないです。また一晩おくとかなりの沈殿がみられるのでかなり不純物も多く含みますが、実験には影響しません。保存はかなり利き、冷蔵庫で１０日おいても反応が見られます。ただし、前述したように多くの不純物（タンパク質）を含むので古くなると腐敗臭が強くなります。
酵素液の働きを調べる
試験管に５％コハク酸ナトリウム水溶液を３ｍｌ、酵素液を５ｍｌ、メチレンブルー一滴を加え、４５℃位のお湯でしばらく湯煎します。普通はツンベルグ管に入れて脱気して行いますが、今回はデヒドロゲナーゼが反応しているかしていないかを見れれば良いので省きました。
デヒドロゲナーゼによってコハク酸から水素が奪われると、その水素がメチレンブルーを還元して無色化するので酵素が反応していることが分かります。今回は大体１０分ぐらいでメチレンブルーが無色になりました。
透析実験
同じようにセロハンで透析してみました。
Ａ：透析しなかった酵素液 Ｂ：透析したセロハン内の酵素液 Ｃ：透析したセロハン内の酵素液にセロハン外の液を加えた
で反応を見たところ、いずれもが反応を示しました。しかし、反応速度はＡ、Ｃ、Ｂの順であったこと、しかも一週間透析したものではそれが顕著にみられたことからもしかして成功かとも思いました。
しかし、もともとコハク酸から水素を奪うときにはデヒドロゲナーゼにＦＡＤが補酵素として働くのですが、このＦＡＤは酵素のタンパク質部分にしっかり結合しているので、透析では分離できないはず。あるいはＮＡＤもコハク酸から水素を奪うときに補酵素として働くため透析によってその差が現れたのでしょうか。だから、Ｂでも反応したのでしょうか。あるいは、透析しなかった酵素液中に腐敗菌が繁殖し、セロハンに封入したものには腐敗菌があまり繁殖しなかったために腐敗菌の呼吸の分が差として現れたのでしょうか。この実験では何ともいえません。
この次はこの結果を検証するために、酵素液を遠心分離しで不純物をでき得る限り少なくし、さらに糖を多量に加えて腐敗菌の繁殖を押さえた透析実験をやってみたいと思います。
チマーゼの実験 ※チマーゼはブフナーが発見した酵母の絞り汁に含まれるアルコール発酵を行う酵素。しかし、実際
には単一の酵素ではなく、アルコール発酵に必要な１２種の酵素と数種の補酵素。
酵素液の作成
市販されているドライイーストを乳鉢で石英砂とともにただひたすら磨り潰す。それを水に溶かし、ろ紙でろ過したものを酵素液として用いる。
酵素液の働きを調べる
酵素液にグルコースを加え、キューネ発酵管に入れ４５℃位のお湯で湯煎する。チマーゼが働いてアルコール発酵がおこれば、二酸化炭素の泡が発生し、アルコールが検出されます。
が、しかし反応が見られない。当然透析実験など出来ない。もちろん対照実験のすりつぶさなかった酵母菌は盛んに発酵している。
酵母が乳鉢では磨り潰せなかったのか顕微鏡で確認してみたが、確かにある程度は潰れている。ただし、ろ液にも若干の酵母菌が見られる。酵素の収量が少ないのだろうか。いったいブフナーはどうやったんだ。
ブフナーの実験
Ｅ・ブフナー（Ｅｄｕａｒｄ Ｂｕｃｈｎｅｒ） １８６０〜１９１７ ドイツ 生化学者
１８９６年ブフナーは酵母菌から薬理作用をもつ物質を抽出するために、培養した酵母菌を破砕し大量の糖を加えました。糖を加えたのは、浸透圧の関係で生き残った酵母菌や雑菌が生育できないようにするためです。
ところが、翌日その死滅したはずの酵母菌が盛んにアルコール発酵をしていたのを発見しました。彼はこの現象の解明に乗り出し、その結果酵母菌の細胞内から分離したタンパク質の一種がアルコール発酵を引き起こすことをつきとめ、このアルコール発酵に関わる一連の酵素をチマーゼと名付けたのです。この発見により１９０７年ノーベル化学賞を受賞しました。
という資料を見つけたが、具体的にどのような操作でチマーゼを抽出したのかがよく分からない。しかし、ブフナーロートなんていうものがあるぐらいだから、ともかく磨り潰してろ過というのは間違いないと思う。さらに調べてみると、フブナーが用いた酵母菌はビールの醸造に用いられる下面発酵酵母で、今回用いた市販されているパン用のドライイーストは上面発酵酵母であることがわかった。抽出した酵素の発酵能力を比較すると後者は前者の４０分の１であるという。どうもこの辺に今回酵素液では発酵しなかった原因があるようだ。
つまり、パン用のドライイーストを磨り潰してろ過して得られる酵素液では薄くて弱いのである。要は濃くて強い酵素液を作れれば良いのである。
今後の課題
では、どうすれば濃くて強い酵素液を作れるのか。もちろん濃いろ液を得たければ、濃い溶液をろ過すればよいのであるが、濃い酵母液では粘性が高すぎてろ過できない。そこで思いついたのが第２３回にやった酵母ビーズでのこと。アルギン酸ナトリウムの繊維に酵母は閉じ込められるのでビーズが作れる。しかし、ヨウ素液やメチレンブルー、酵素などはその繊維には閉じ込めきれずに漏れ出す。つまり、酵母菌を磨り潰したもので酵母ビーズをつくれば、容易に酵母と抽出液の分離ができ、さらに、多くの酵母ビ−ズを作っては取り出しすれば、いくらでも濃い抽出液が得られるはず。やってみる価値はありそうだ。
また、下面発酵酵母も地ビールのメーカーから分けてもらえないだろうか。この２つを併用すればブフナーの実験が再現できると思うのだが。
しかし、単純にハーディとヤングの透析実験だけなら、チマーゼさえ入手できれば何とかなるかもしれない。だが、現在チマーゼは販売していないようである。やはり抽出からになりそうだ。
まとめと反省
はっきり言えば、今回の目的はアポ酵素と補酵素の分離、およびその実験をやってみたかったのである。資料集などではチマーゼでの例が載っているが、これが上手くいかない、特に発酵では反応しているのかしていないのかが判り難いので、比色で反応が判り易い酵素であるウレアーゼやデヒドロゲナーゼでアポ酵素と補酵素の分離を試してみたのである。だが、結果的に言うならば、全て失敗したことになる。しかし、前述したようにデヒドロゲナーゼではもしかしてがあるかもしれない。今後はこの追試と、今後の課題で述べたかたちでチマーゼの実験を改良してやってみたいと思う。
熊谷高校 加藤 隆
Omnisサークル次回活動の予定
日時 ２月１６日（土）３：００
場所 埼玉県立上尾高等学校 於生物室
テーマ 花粉管の伸長と胚珠の観察
参加自由。希望者は連絡下さい。 ymorita@mb.infoweb.ne.jp