ホタライトを用いたルシフェラーゼの実験

                
第30回(平成14年3月2日 於越谷南高校)

参加者: 古内(三郷高)、阿部(上尾南高)、森田(川越女子高)、小林(熊谷高)、加藤(熊谷高)、小栗(秀明栄光高)、平岩(越谷南高) 敬称略


簡単にルシフェラーゼの実験を行えるホタライトを購入し、温度とpHの影響を調べる実験をした。

<準備>
・ ホタライト(キッコーマン株式会社)
A粉末はルシフェラーゼ、B粉末はルシフェリンとATPが含まれているようである。普通は、A粉末、B粉末ともに50mlの水に溶かし、A、Bを等量混合して発光させる。


・ 緩衝液
pH2,3,4  0.2Mグリシン-塩酸緩衝液
pH5,6    0.2M酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
pH7,8    0.2Mトリス-塩酸緩衝液
pH9,10,11,12  0.2Mグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液
・ 温度計
・ 試験管
・ pHメーター
・ 氷
・ ビーカー


<方法と結果>
A.温度の影響
1. A粉末、B粉末ともに50mlの水に溶かし、A溶液、B溶液とした。
2. 2本の試験管にA溶液、B溶液をそれぞれ別々に4ml採ったものを7組準備した。
3. 500mlのビーカー7個にそれぞれ0,10,20,30,40,50,60℃に合わせた水を入れ、そこに、A溶液、B溶液を1組づつ入れて、しばらく放置した。
4. A溶液、B溶液を混合して、発光させ、温度の影響を観察した。40℃が最も明るく見えた。

5. Photoshopを用いて、上の画像をグレースケールに変換し(下図)、各試験管の任意の5箇所の明度を測定し、平均化した値から温度依存曲線を作成した(下のグラフ)。40℃付近が最適温度であった。



B.pHの影響
1.A粉末、B粉末ともに25mlの水に溶かし、A溶液、B溶液とした。
2.<準備>で示した緩衝液を、それぞれ4mlづつ別々の試験管に入れた。
3.それぞれの試験管に、B溶液2mlを加えた。


4.A溶液2mlをそれぞれの試験管に加え、発光させた。pH8〜9が最も明るかった。しかし、pH4も予想以上に明るかった。


5.温度の場合と同様にして、画像をグレースケールに変換し、それぞれの試験管の任意の5箇所から明度を測定し、平均化した値から下のグラフ(pH依存性1)を作成した。pH8〜9の明度が高いが、pH4の明度も高くなっていた。

「6.反応終了後、それぞれの溶液のpHを確認するため、pHメーターで測定したところ、次の表のようになった。

緩衝液のpH 10 11 12
反応液の実際のpH 2.7 4.1 7.2 5.7 7.1 7.4 8.4 9.5 10.3 10.8 12.0


7. 作成した緩衝液のpHとは、かなりずれていることがわかった。表中の実際のpHの値を用いて、pH依存性1を修正すると、次のpH依存性2になり、pH8〜9付近が最適pHとなった。

8. 緩衝液のpHがずれる理由として、A粉末、B粉末に緩衝剤が入っていることが考えられる。A溶液、B溶液のpHを測定すると、両者ともpH8前後であった。pH8程度の緩衝剤が入っている可能性がある。

<感想>
簡単に、ルシフェラーゼの実験を行うことができ、発光が非常にきれいであるため、生徒の興味を引く教材であると思う。しかし、実際に生徒実験に用いるにはやや高価であり、十分に暗くしないと、きれいな発光を見られないこと等が問題である。部活動等で、夜に、少人数で実験するような時には、非常に有効であろう。
また、今回の実験では、温度の影響は、明確であったが、pHの影響は、はっきり出たとは言いがたい。明確な実験結果を得るには、強い緩衝液を用いるか、緩衝剤を含まないルシフェラーゼや基質を準備する必要があると思われる。なお、ホタライトに含まれる緩衝剤についてキッコーマン株式会社にメールで問い合わせたが、現在までのところ回答を得ていない。

            

文責 平岩真一(越谷南高校)(hiraiwa@sam.hi-ho.ne.jp


Omnisサークル次回活動の予定
  日時  4月20日 (土)3:00
  場所  埼玉県立川越女子高等学校 於生物室
  テーマ チマーゼの抽出(予定)
  
  参加自由。希望者は連絡下さい。  ymorita@mb.infoweb.ne.jp

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