参加者：　阿部（上尾南高）　小暮（上尾南高）　加藤（熊谷高）　小林（熊谷高）　平岩（越谷南高）　小栗（練馬区立関中学校）　古内（三郷高校）　吉川（玉川工業高校）　森田（川越女高）　敬称略

［歴史的背景］
　化学者リービッヒは、アルコール発酵のしくみについて、酵母の解体に伴って起こると考えた。窒素を全く含まない溶液ではアルコール発酵が起こらないことから、窒素を含む酵素が分解していく過程の影響で化学的に発酵が起こると考えた。
　それに対して、パスツールは酵素とは酵母そのものであり、アルコール発酵は酵母の成長の過程で生ずるもので化学的なものではないと考えた。
　この二人を中心とした論争は、両者の死を持っても決着が付かなかった。
　この問題に、決着を付けたのが、ブフナー兄弟である。
　兄のハンス・ブフナーは北里柴三郎らが発見した「抗毒素」に興味を持った。この抗毒素はもともと細菌に含まれていたものではないかと考え、生きている細菌から生きているタンパク質（原形質）を抽出しようと試みた。しかし、生きている細菌を大量に培養するのは大変なので、酵母で予備実験をすることにした。弟のエドュアルト・ブフナーは、兄から酵母を破砕する方法を考えるように言われた。彼は、酵母を細かい砂とともに乳鉢で磨りつぶす方法を考えた（手では大変なので乳棒をモーターで回転させた）。兄ハンスはこの方法で破砕したものにケイ砂を加えパサパサの粉にし、布の袋に入れて、マンハイム水圧プレスにかけて約９０気圧の圧力をかけて、やや濁った黄色い液体を得た（１kgの酵母から４００ml）。この液を顕微鏡で観察したところ酵母はいなかった。酵母抽出液は数日で分解してしまった。そこで、ハンスは腐敗防止の目的で食塩、グリセリン、ブドウ糖（４０％）をそれぞれ加えるように指示した。助手が保存剤を加えて夏休みに入ったあと、弟エドュアルトは数日後ブドウ糖を加えたビンから泡が発生しているのを観察して驚いた。
　この観察に、兄ハンスはあまり興味を持たなかったので、弟エドュアルトが単独で論文発表した。
　この実験により、パスツールとリービッヒの論争には決着が付いた。アルコール発酵は生きている酵母が生産する酵素によって行われていたわけである。

参考文献「生化学の夜明け」（丸山工作著）、「チトクロムと細胞呼吸」（David Keilin）　

［方法］
＜酵母の準備＞
ビール会社から分けていただいた上面発酵酵母をブフナー漏斗を使って集めた。

１．乳鉢にケイ砂を入れて、磨りつぶし、布で圧搾してみる。

（１）乳鉢の中に酵母を入れ、２倍体積ほどのケイ砂を入れて２０分ほど磨りつぶす
（２）サイフォン用のネル布に入れて、ニンニク搾り器で絞る。
（３）抽出液を観察するととても、酵母がいない状況ではなかった。

発酵させると発酵するがこれは当然……。

２．ザイモリエースで処理したあと、ガラスビーズを入れてすり潰してみる。
(1)ショ糖液（1.2Mショ糖（ソルビトールのはずだったのですが、なかったので……まずかったかも？）、50mMトリス（pH7.5）、100mMEDTA）５０ｍｌに細胞を懸濁し、ザイモリエース酵素溶液（10mg/ml zymolyase-20T)2mlと、βメルカプトエタノールを終濃度0.2%になるように加え、３７度Cで撹拌しながら保温。

（ゲゲ(゜_゜;)、発酵し始めちゃった。ソルビトールの代わりにショ糖を入れたのがまずかった。当たり前ですよね。）
(２)遠心後、ショ糖液で懸濁して、再び遠心（洗浄）

(3)50mMトリスに懸濁し、ガラスビーズ（0.35mm-0.55mm、一晩水にさらした物を使用）を２倍体積ほど入れて２０分間氷水中で磨りつぶした。

(4)ブフナー漏斗で吸引濾過して菌体を除去。

菌体はほとんど観察されなかった。また、ある程度は破砕できたようである。
(5)キューネ発酵管に入れて観察した。
……残念ながら、一晩経っても発酵しなかった。(; ;)　う〜ん、実験失敗。
(6)酵母の破砕がうまくできていなかったのか、あるいはその過程で酵素が失活したのか……。確認のために、コハク酸脱水素酵素の活性を見てみることにした。
　　→　　　
ちょっとメチレンブルーの量が少なくて、最初の色が薄かったが、活性はちゃんとあった。

［感想］
・ソルビトールがないという、基本的な部分での失敗があった。（ショ糖が発酵に使われても浸透圧は維持できたと思うのだが…）
・実験操作に不慣れなための失敗も考えられる。
・教えていただいた操作方法を省略した部分もあるので、今度は忠実に実行してみたい。
・ブフナーは、数％程度の発酵の活性を観察しているので、うまく行っていれば、キューネ発酵管でも観察できるはずである。

　そこで、この方法で何度か試してみるつもりである。
　それでもダメなら、実際に酵母を扱っている研究室に行って、試してみたい。

Omnisサークル次回活動の予定
　　日時　　 ５月２５日（土）３：００
　　場所　　埼玉県立熊谷高等学校　於生物室
　　テーマ　細胞性粘菌の観察（予定）
　　
　　参加自由。希望者は連絡下さい。　　ymorita@mb.infoweb.ne.jp

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