第77回(平成20年7月12日於上尾南高校)

テーマ:体細胞分裂観察の条件2

内容:ネギ発根種子根端における体細胞分裂の様子を観察する染色方法の最適条件とは。


参加者:平岩(川口県陽高(定))、朝日(浜島書店)、村松(浜島書店)、森田(志木高)、阿部(上尾南高)  敬称略


<はじめに―体細胞分裂の染色>

前回の続き。色々な染色液を用いて、その染色の様子を比較してみた。


<準備>


ネギの発根種子(23℃で60時間吸水させたもの)
酢酸オルセイン
サフラニン溶液
メチレンブルー
酢酸カーミン
ギムザ液
シッフ試薬
酢酸ダーリアバイオレット(ダーリアバイオレット0.1gを室温の30%酢酸20mLに溶かしたもの)
1規定塩酸

<方法と結果>

  1. 発根種子は、数日程度なら冷蔵保存が可能である。適当な長さに伸びてきたら、使用するまで冷蔵庫に入れておくとよいだろう。
  2. 酢酸オルセイン、サフラニン溶液、メチレンブルー、酢酸カーミン、ギムザ液、シッフ試薬の各染色液を、7:3の割合で1規定塩酸と混合し、解離・染色液を用意した。


  3. 各染色液の中に10分浸して解離・染色を行った後、純水中で2分間脱色した。

  4. プレパラート作成

    水洗した後、根端を0.5mm切り落とし(左図)、カバーガラスを被せて上から押しつぶす。
    切り落とすのは、カミソリ、カッター、メス等何でもよいが、カバーガラスの縁を用いるのが最も簡便である。
    押しつぶす前に、爪楊枝の尻で、軽く丹念に叩くことで、根端組織を砕くとよい。潰れた組織の輪郭が見えなくなる程度を目安とすると、失敗が少ない。
  5. 検鏡結果



    上左:酢酸オルセイン、上右:サフラニン溶液
    中左:メチレンブルー、中右:酢酸カーミン
    下左:ギムザ液、下右シッフ試薬
    この実験の定番である酢酸オルセインを基準として、各染色液の結果を比較してみる。
    サフラニン溶液が思ったより好結果を得られた。細胞壁の染色液という印象があったので、意外であった。酢酸オルセインと比較すると、やや見劣りする印象があった。
    メチレンブルーは間期の細胞より分裂期の細胞の方が濃く染色されるので、生徒には探しやすいかもしれない。ただし、酢酸オルセインと比較すると、はっきりとした顕微鏡像が得られなかった。
    酢酸カーミンは、この染色時間では薄すぎて使い物にならなかった。綺麗な染色を行うには、染色時間を延ばすか、温めるかしなければならないようである。ただし、品質の良い試薬を用いれば結果は異なるかも知れない。
    ギムザ染色もメチレンブルーと同様に、分裂期の細胞の方が濃く染色され、観察が容易であった。しかし、酢酸オルセインに比べると、やや不鮮明であった。
    シッフ試薬は全く染まっていなかった。塩酸中で加水分解されたDNAのアルデヒド基を染色する試薬だからなのか、塩酸を混ぜて解離と同時に染色することは出来ないようであった。
  6. 1規定塩酸に10分浸してから、シッフ試薬で30分染色を行ってみた。

    今度は綺麗な染色像が得られた。細胞質が染色されないため、染色体は綺麗に見えた。しかし、酢酸オルセインに比較すると、よく言えば上品、悪く言えば薄ぼんやりとしていて、強烈な印象に欠ける。また、生徒実習用と考えた場合、手間と時間がかかるのが難点である。
  7. 結局、前回使用した酢酸ダーリアバイオレットで染色するのが最も簡便で、最も失敗が少なく、はっきりとした染色体を観察できた。標本が避ければ、染色分体を観察することすら可能であった。

    酢酸ダーリアバイオレットで染色した染色分体
  8. 参加者から、酢酸ダーリアバイオレットでは、染色時間を伸ばすと濃く染まりすぎないか?という声が上がったので、染色液の濃度を変えて染色してみることにした。


    左…酢酸ダーリア:塩酸=7:3、中…酢酸ダーリア:塩酸=5:5、右…酢酸ダーリア:塩酸=3:7
    さすがに3:7では薄すぎるようだが、5:5でも実用上は全く差し支えない像が観察できた。

<結論>

<参考文献>

文責:阿部(上尾南高校)


Omnisサークル次回活動の予定
  日時   10月11日(土)14:00
  場所  埼玉県立大宮高等学校 於生物室
  テーマ 「珪藻の観察」
  
  参加自由。希望者は連絡下さい。  ymorita@mb.infoweb.ne.jp