テーマ：ヒル反応−再び−

　前回の失敗を反省をもとに、再びヒル反応の再現に挑戦！

今回は、葉緑体の調整法などをできるだけちゃんと行いました。

　資料の一つは私の卒業研究（面目ない(^_^;)、私の卒業研究はヒル反応が基礎でした。研究室では酸素電極を使って酸素濃度を測定していたので、今回のような実験は行っていませんが。）
　もう一つの資料はヒルの論文（Hill R (1939) Ocygen produced by isolated chloroplasts. Proc R Soc London Ser B 127:192-210……知り合いの大学の先生にコピーをもらいました）

　高校の教員は、大学の先生にお願いしないと論文のコピーを手に入れることができません。この現状をなんとかしてもらえないでしょうか。

［葉緑体の調整］
ホウレンソウの若い葉の付け根部分（写真で持っている部分）だけを取る。


ＳＴＮを１００ｍｌ加えて、２分間粉砕。
ＳＴＮ……０．４Ｍのショ糖液、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ


さらしで絞り


１０００ｒｐｍ　５分で遠心し、上清を取る。
３５００ｒｐｍ　１０分遠心し、沈殿を得る。
沈殿をＳＴＮで懸濁。
再び　３５００ｒｐｍ　１０分遠心し、沈殿を得る。
沈殿をＳＴＮで懸濁し、葉緑体懸濁液とする。


葉緑体懸濁液１ｍｌをＳＴＮで１０倍に希釈し、ヒル酸化剤（終濃度２ｍＭフェリシアン化カリウム）を加え、あとは前回と同様に脱気した後、光を照射した。


前回とは異なり葉緑体懸濁液も良い色(^_^)、盛んに発泡している（減圧しているので必ずしも酸素とは限らないが）。
最初の１本は、ヘモグロビンの色も明るくなったようだ。

しかし……。
２本目以後、発泡はあるものの、ヘモグロビンの色に変化はない……。




［脱気方法の検討］
前回は１０分ほど脱気しましたが、色が変化するギリギリのところで脱気を止めた方が感度が良くなるのではないかと思い、今回は２０秒間だけの脱気にとどめました。
それでも、変化なし。

前回よりも酸素発生の手応えはあるものの、ヘモグロビンの変化をとらえることができない。
原因を考えてみると今回と、ヒルの実験ではいくつ過去となる部分がある。

・　ヒルは、酸化剤にシュウ酸鉄（ＩＩＩ）を使用しているが、この試薬は日本では売られていない。
・　ヒルは、ヘモグロビンに、牛肉から抽出した「筋肉ヘモグロビン」（おそらくミオグロビンのことか）を使用している。
・　ツンベルグ管は使用しているが、ヘモグロビンを葉緑体懸濁液に直接混ぜて使用している。（今回の方法では混ぜると、フェリシアン化カリウムの影響で極端に暗い赤になってしまう）
・　ヒルは、ヘモグロビンの色の変化を肉眼ではなく、分光光度計を使って測定している。

まだ、工夫の余地はありそうだ。
もう少し、ヒルの論文をよく読んで改善策を検討したい。
次回までには間に合いそうもないので、一旦ここで、このテーマから離れるが、いつか成功させようと思う！！
（どなたかアドバイスを下さい）

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